Redox Biology | 国家重点研发计划首席科学家教授团队深度解析色氨酸代谢物3-HAA—治疗BPD的 “秘密武器”

英文标题：The tryptophan metabolite 3-hydroxyanthranilic acid alleviates hyperoxia-induced bronchopulmonary dysplasia via inhibiting ferroptosis

中文标题：色氨酸代谢产物3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)通过抑制铁死亡缓解高氧诱导的支气管肺发育不良

发表期刊：Redox Biology

影响因子：10.7

客户单位：重庆医科大学附属儿童医院

百趣提供服务：色氨酸高通量靶标代谢组学、MetPro-Ⅱ代谢物与蛋白相互作用

支气管肺发育不良(Bronchopulmonary Dysplasia, BPD)是一种常见于早产儿的慢性呼吸系统疾病。随着极早产儿存活率的提升，支气管肺发育不良的发病率却居高不下，这严重影响了早产儿的生存率和生活质量。探索BPD的潜在机制有助于开发新的有效治疗策略。

有研究表明，色氨酸代谢物吲哚-3-乙酸在慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)中具有调节炎症、改善肺气肿和缓解肺功能下降的潜在作用。由于COPD与BPD有一些共同的病理特征，而色氨酸代谢在病理条件下会受到影响，所以色氨酸及其代谢物是非常有吸引力的诊断、预后和治疗生物标志物。此外，色氨酸代谢物的生物学效应及其在疾病中的变化表明，它们可能作为潜在的治疗靶点。但目前，色氨酸代谢产物在新生儿BPD中的复杂功能和机制仍有待探索。

研究者运用UHPLC-MS/MS代谢组学技术（由上海百趣生物提供支持），对BPD婴儿和非BPD婴儿的气管吸出物(Tracheal Aspirates, TAs)中的色氨酸代谢物含量展开分析（图1A）。经鉴定，TAs中存在21种代谢物，其中BPD组的3-HAA和ILA相较于对照组呈现降低趋势（图1B-C）。

鉴于临床样本中这一发现，为进一步探究色氨酸代谢失调是否也存在于实验环境中，研究者构建了成熟的SD大鼠高氧诱导的BPD模型。与对照组相比，BPD组的肺泡明显简化，这表明其肺发育受到了损害（图1D）。在大鼠实验中，鉴定出27种代谢物，且肺组织中的代谢物改变更为显著。其中，BPD组的3-HAA、NAS、5-HTOL较对照组降低（图1E-F）。综上所述，无论是在BPD组的TA样本还是肺组织中，3-HAA均出现减少情况，因此后续围绕3-HAA展开了进一步深入研究。

研究者通过对大鼠肺组织进行3-HAA的IHC染色（图 2A），对肺泡II型上皮细胞(AECII)进行3-HAA的IF染色（图2G），证实了体内和体外高氧模型中3-HAA的减少。为了研究各组间3-HAA水平差异的根本原因，研究者对大鼠肺组织进行了3-HAA代谢相关酶KMO、KYNU和HAAO的WB分析（图2B-C）和IHC染色（图2D-F）。结果表明，BPD组KMO和KYNU蛋白表达降低，导致3-HAA产生减少，而HAAO蛋白表达升高导致3-HAA下游代谢增加。此外，AECII的WB分析（图2H-I）和IF染色（图2J-L）显示了类似的模式：高氧组KYNU和KMO降低，HAAO升高。RT-qPCR结果在体内和体外高氧模型中也是一致的，为体内和体外模型中观察到的差异提供了合理的解释。总的来说，BPD与3-HAA降低有关，这部分是由相关代谢酶的失调引起的。

研究者深入探究了补充3-HAA能否缓解高氧诱导的BPD，在为期14天的高氧建模期间，BPD+3-HAA组的大鼠按照特定方案，隔天接受3-HAA雾化处理（图3A）。结果显示，3-HAA雾化展现出良好效果，具体表现为显著改善了组织病理学状况，使得 MLI（平均线性截距）数值明显降低（图3B），这反映出肺泡结构得到优化。同时，3-HAA雾化有效地提升了体内3-HAA的水平（图3C），为发挥其保护作用提供了物质基础。尤为关键的是，3-HAA对高氧处理后的SPC细胞起到了明显的保护作用（图3D），有助于维持AECII的正常功能。在蛋白水平层面，3-HAA显著降低了MPO和COX2的表达，有力地减轻了炎症反应，同时增加了SPC的表达，使得AECII损伤得到明显改善（图3E）。总体而言，3-HAA通过改善肺泡复杂性、抑制炎症，对高氧诱导的BPD大鼠模型的肺损伤切实发挥了保护作用。

研究者为了探索3-HAA减轻新生大鼠高氧诱导的BPD的潜在机制，通过LiP-SMap方法（MetPro-Ⅱ代谢物与蛋白相互作用，由百趣生物提供）进行了蛋白质组学研究（图4A）。KEGG通路分析和GO分析富集到一种特定形式的细胞死亡，称为铁死亡，这是一种铁依赖的，脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式（图4B-C）。Fe²⁺参与芬顿反应，加剧了脂质过氧化和细胞损伤。富含磷脂的线粒体膜特别容易受到氧化损伤，导致线粒体功能障碍和能量代谢受损。接下来，研究者通过评估铁死亡相关蛋白和mRNA表达、醛和Fe²⁺来评估铁死亡。研究结果显示，高氧诱导的BPD导致肺组织中总醛、亚铁、MDA和4-HNE含量升高，BPD+3-HAA组显著降低（图4D）。此外，经过3-HAA处理后，与BPD组相比，长链酰基辅酶A合成酶4(ACSL4)、转铁蛋白(TF)、铁蛋白重链1 (FTH1)、核受体共激活因子4(NCOA4) 和微管相关蛋白轻链3B-II(LC3B-II)降低，而谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)升高（图4E）。利用透射电镜观察大鼠肺组织AECII的线粒体改变，揭示了典型的铁死亡相关变化，如线粒体固缩和嵴丢失，3-HAA治疗减弱了这些线粒体异常（图4F）。综上所述，3-HAA可抑制高氧诱导的BPD大鼠模型中的铁死亡，从而减轻肺损伤。

AECII持续损伤与BPD发生发展密切相关，前期体内实验发现大鼠肺组织AECII存在线粒体铁死亡样变化。研究用CCK-8确定3-HAA、铁死亡诱导剂erastin和抑制剂DFO的最佳浓度，确定最佳浓度后开展体外实验。结果表明，3-HAA和DFO减弱高氧诱导的细胞转化，erastin则逆转3-HAA的作用。在高氧诱导的AECII细胞模型中，用荧光探针DCFH-DA检测的活性氧(ROS)水平（图5A）以及用Liperfluo荧光检测的脂质过氧化程度（图5B），与对照组（C组）相比均显著升高。补充3-HAA和DFO可减少过量的ROS和脂质过氧化产物的生成，而Erastin可逆转这一作用。此外，氧化还原和铁死亡相关指标的含量变化也呈现相似趋势。例如，Fe²⁺、总醛、MDA和H₂O₂，在高氧组（H组）和高氧+3-HAA+Erastin组（HAE组）中升高，经3-HAA和DFO处理后则降低。同样地，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平在H组和HAE组中降低，在高氧+3-HAA组（HA组）和高氧+3-HAA+DFO组（HAD组）中升高（图5C-E）。与H组相比，AECII中FTH1、NCOA4、COX2和LC3B-II的蛋白质水平在3-HAA和DFO处理后也降低，而GPX4表达升高（图5F）。然而，3-HAA的抗铁死亡作用被Erastin逆转。由于暴露于高氧环境，AECII细胞出现线粒体收缩和线粒体膜密度增加的现象。3-HAA和DFO处理减轻了线粒体的改变，因为它们在预防铁死亡中起着关键作用。相比之下，Erastin激活了铁死亡，并阻断了3-HAA的保护作用（图5G）。综上所述，这些研究结果表明，3-HAA减轻了高氧诱导的AECII铁死亡。

研究者运用LiP-SMap方法探寻3-HAA的作用机制，发现FTH1极有可能是3-HAA的结合对象（图6A） 。为进一步明确二者关联，采用表面等离子共振技术，深入剖析它们之间的结合动力学与分子亲和力。实验数据清晰显示，3-HAA对FTH1的亲和力呈现出显著的剂量依赖特性（图6B），这表明二者结合紧密。为直观展示FTH1与3-HAA的相互作用方式，研究者借助分子对接技术，精准揭示了二者结合模式（图6C）。结果表明，3-HAA巧妙地通过氢键与 FTH1上的SER31和SER59残基相连。鉴于 NCOA4与FTH1的相互作用在铁蛋白自噬进程中至关重要，研究者再次运用SPR技术，探究3-HAA是否通过干扰NCOA4-FTH1相互作用，来影响铁蛋白自噬。实验结果显示，重组的FTH1能够以高亲和力与重组NCoA4蛋白特异性结合（图6D） 。然而，当体系中引入3-HAA后，FTH1-NCOA4的结合进程被有效阻断（图6E）。为进一步验证该结果，研究者开展了免疫共沉淀实验。结果显示，相较于高氧组AECII，经3-HAA处理后的细胞中，NCOA4与FTH1之间的相互作用明显减弱，在抗NCOA4抗体拉下的免疫沉淀产物中，FTH1的含量显著减少（图6F）。综上，外源性补充3-HAA能够直接靶向FTH1，通过破坏NCOA4-FTH1相互作用，有效缓解铁死亡进程，进而在体内体外实验中，显著抑制高氧诱导的AECII损伤，为BPD的治疗提供了全新的理论依据与潜在靶点。

BPD是需要呼吸支持的早产儿中最常见的慢性肺部疾病。由于缺乏有效的预防和治疗策略，BPD婴儿的死亡率高于非BPD早产儿，预后较差，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。了解BPD的潜在发病机制对于制定有针对性的干预措施至关重要。最近的研究强调了代谢功能障碍在高氧引起的肺损伤中的作用。在本研究中，作者旨在探讨色氨酸代谢物在预防高氧诱导的BPD中的潜在作用，并探讨其可能的机制。

本研究首次揭示了BPD与3-HAA水平显著降低相关，表明色氨酸代谢途径失调。补充3-HAA通过靶标FTH1抑制铁死亡途径，从而减轻大鼠和AECII的高氧诱导损伤。本研究强调了靶标3-HAA和铁死亡的临床应用潜力，并为BPD的管理和治疗提供了新的视角。